蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）保姆級教程

Part1：實驗方案

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白。

我們的Western Blot實驗方案包含蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、檢測（圖1）及所涉及的試劑，為您的WB實驗保駕護航。

圖1、Western Blot實驗步驟

● 蛋白提取

1、使用Trident Extraction Kits從樣本（細(xì)胞或組織）中提取蛋白。

（注：根據(jù)蛋白與抗體的具體情況優(yōu)化細(xì)胞數(shù)量以及上樣量）

2、蛋白濃度定量，在-20℃或更低溫度下冷凍保存。

3、在樣品中加入Trident Sample Buffer，100℃煮沸5mins，使蛋白質(zhì)變性；瞬時離心上樣。

（注：必要時，使用前在Trident Sample Buffer加入二硫蘇糖醇（DTT）或/3-巰基乙醇（2-ME））

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● SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜

1、將30 µg蛋白或 100 ng純化蛋白裝入SDS-PAGE凝膠孔中。

在SDS-PAGE凝膠孔中加入適量的Trident Blue Prestained Protein Ladder (GTX16376) 或 Trident Prestained Protein Ladder（高范圍：GTX50875 或標(biāo)準(zhǔn)范圍：GTX49384）裝入1個或多個額外的泳道中。

2、使用1x Running buffer以50-100 V的電壓運行1-2小時。建議將電壓調(diào)低并延長時間?？墒箺l帶更清晰，分辨率更高。

3、在Transfer buffer中將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或甲醇漂洗過的PVDF膜上。

（可選：在進行下一步之前，通過 Ponceau Red染色確認(rèn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移成功）

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● 封閉、孵育抗體、洗膜

1. 封閉：在3%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中封閉30-60分鐘。

2. 一抗孵育：將膜置于含適當(dāng)稀釋一抗的1%脫脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中，在RT下孵育兩小時或在4°C下過夜。

3. 洗膜：1x PBST ，一次10分鐘，兩次5分鐘。

4. 二抗孵育：將膜置于含適當(dāng)稀釋二抗的1%脫脂奶/PBST 或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中孵育1小時。

5. 洗膜：1x PBST ，三次，每次10分鐘。

（注：Trident Universal Protein Blocking Reagent不含任何動物血清，適用于WB、ELISA、IHC和ICC/IF實驗）

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● 基于ECL成像

按照Trident plus Western HRP Substrate（GTX400006）或Trident femto Western HRP Substrate（GTX14698）來檢測信號。

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